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核酸定量檢測試劑實驗前準備工作

更新時間:2025-05-26      點擊次數:108
  核酸定量檢測試劑(如熒光染料法、探針法或數字PCR試劑)是分子生物學實驗中的核心工具,其使用規范直接影響實驗結果的準確性和可靠性。以下是詳細的操作規范和注意事項:
  一、核酸定量檢測試劑實驗前準備:
  1.試劑與材料檢查
  試劑完整性:確認試劑盒組件完整(如反應液、酶、陽性對照、陰性對照、標準品等),無泄漏或污染。
  儲存條件:確保試劑未過期,儲存溫度符合要求(如-20℃避光保存,部分需冷藏或冷凍)。
  耗材滅菌:使用無菌離心管、吸頭、PCR管等,避免核酸污染。
  2.儀器校準與維護
  PCR儀:校準溫度準確性。
  熒光檢測儀:設置正確的激發/發射波長,調整增益值。
  移液器:校準移液體積,建議使用帶濾芯吸頭避免交叉污染。
  3.實驗設計
  對照組設置:
  陽性對照:已知濃度的靶核酸(驗證試劑有效性)。
  陰性對照:無模板空白(檢測污染或假陽性)。
  標準曲線:至少5個梯度濃度標準品,用于定量計算。
  樣本處理:提取核酸后測濃度,確保純度達標。
  二、核酸定量檢測試劑操作規范:
  1.反應體系配制
  冰上操作:在低溫環境中配制預混液,減少非特異性擴增。
  精準加樣:按試劑盒說明書添加各組分(如模板DNA、引物、探針、熒光染料),建議先配制標準品再處理樣本。
  避免氣泡:混勻后短暫離心,確保反應液集中于管底。
  2.PCR擴增
  循環參數:嚴格遵循試劑盒推薦的循環條件。
  熒光采集:在退火或延伸步驟末尾檢測熒光信號(避免信號飽和)。
  防污染措施:
  分區操作(試劑配制區、加樣區、PCR產物分析區)。
  使用紫外燈或核酸清除劑定期消毒實驗臺。
  3.數據分析
  基線校正:選擇指數擴增階段的熒光信號作為分析窗口。
  閾值設定:手動或自動設定閾值,確保標準品和樣本的Ct值在合理范圍內。
  標準曲線法:
  以標準品濃度的對數為橫坐標,Ct值為縱坐標,擬合線性方程。
  根據樣本Ct值代入方程計算靶核酸濃度。
  結果驗證:
  陽性對照應呈現典型擴增曲線,陰性對照無信號。
  重復實驗至少2次,確保數據可重復性。
 

 

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